Gota Gruesa

MATERIAL
LANCETA
TORUNDAS

El examen de un preparado de sangre en "gota gruesa" es el primer paso para el diagnóstico. Si son vistos parásitos, se debe hacer un extendido para verificar la especie.

Gota gruesa: se coloca una gota de sangre en un portaobjetos limpio y con la esquina de otro, se disemina la sangre hasta llegar a un diámetro de más o menos 1 cm. El espesor debe ser tal que permita leer a través de la preparación.

En la imagen al lado, de una preparación de gota gruesa, se observan numerosos anillos de Plasmodium (flechas). Compare con el tamaño de los neutrófilos.El único diagnóstico que puede hacerse es que hay una infección malárica. Hay que hacer extendidos para identificar la especie.
Las preparaciones se dejan secar y se colorean con la técnica de Giemsa.

El extendido se hace con la misma técnica de los hematológicos: una gota de sangre se coloca en una punta de un portaobjetos limpio y, con el lado menor de otro portaobjetos, se extiende para obtener el espesor de UNA célula.
Las preparaciones se dejan secar y se colorean con la técnica de Giemsa.








PLASMODIUN FALCIPARUM





a, b, c: trofozoítos jóvenes.

d, e, f: trofozoítos en crecimiento (en capilares)

g: esquizonte

h: fin de la esquizogonía

i, j, k, l: diferentes micro y macrogametocitos









Observe que:


1- los glóbulos rojos NO están agrandados.

2- los anillos son delicados y puede haber más de uno por célula.

3- algunos anillos pueden tener dos núcleos.

4- No es común ver formas maduras en los extendidos de sangre.

5- los gametocitos tienen forma característica de luna en cuarto creciente. Los gametocitos no aparecen en

sangre durante las primeras 4 semanas de infección.

Sedimento Urinario

El examen del sedimento urinario aporta datos de gran valor diagnóstico en casos de infección del tracto urinario o bacteriuria asintomática. Los hallazgos de células, cilindros y cristales nos pueden indicar patologías dependiendo de su tipo y cantidad.

El examen del sedimento urinario técnicamente bien hecho, es de gran valor para establecer el diagnóstico de infección del tracto urinario y detectar una bacteriuria asintomática. La orina contiene elementos que son patológicos o no en función del tipo y la cantidad: células, cilindros y cristales.
Para realizar la prueba es necesario concentrar la orina 10 veces mediante centrifugación a 500x g, durante 5 minutos, recuperar el pellet y hacer la observación en fresco con el microscopio de campo claro, en contraste de fase y con luz polarizada.
El sedimento ha de teñirse con panóptico, Papanicolau o Hansel cuando se quiere distinguir tipos de leucocitos. La tinción de Gram puede ser útil para diferenciar bacterias, pero no se emplea en el screennig. Si se necesita descartarLeptospira spp., el sedimento ha de obtenerse centrifugando a 2000x g durante 10 minutos y estudiarse en microscopía de campo oscuro o contraste de fase II ó III.

Elementos celulares del sedimento
Los elementos celulares del sedimento urinario tales como hematíes, leucocitos y células epiteliales, pueden tener origen en cualquier parte de las vías urinarias.

• Hematíes. El hallazgo de hematíes en el sedimento urinario establece el diagnóstico y la procedencia de la hematuria. En la orina en condiciones normales, no se encuentran hematíes, pero sólo tiene valor diagnóstico la presencia >10 hematíes por campo de 40 aumentos. Cuando el resultado de hematíes de la tira reactiva es 0-0 y observamos hematíes en el sedimento urinario hablamos de microhematuria. Los hematíes procedentes de alteraciones glomerulares, sufren dismorfias estructurales al atravesar la membrana basal del glomérulo (anulares, vacíos, espiculados, mono y polidiverticulados, fantasmas gigantes y estrellados). Cuando se trata de microhematurias sin afección glomerular los hematíes son isomórficos o post glomerulares. La diferenciación se realiza mejor en contraste de fase o con luz polarizada.
• Leucocitos. En una orina normal se admite la presencia de hasta siete leucocitos por campo de 40 aumentos, cuando aparecen en mayor cuantía se asocia a un proceso potencialmente bacteriano. Si la orina presenta aspecto purulento y al microscopio tiene predominio de neutrófilos degenerados y baja afinidad a la tinción, diremos que es una piuria. La presencia de leucocitos o pus en la orina indica inflamación en algún punto de las vías urinarias, la pelvis renal o la vejiga y su presencia es particularmente elevada en las inflamaciones agudas. En animales febriles o con tumores de las vías urinarias y otros trastornos inflamatorios podemos encontrar leucocituria moderada. Existe leucocituria fisiológica después del ejercicio fuerte, como en caballos o perros después de correr. La presencia de otras células leucocitarias en el sedimento urinario tiene un significado diagnóstico diferente.
• Eosinófilos. El hallazgo de eosinófilos en la orina siempre tiene valor diagnóstico cuando es > 1% de los leucocitos urinarios. La eosinofiluria aparece en animales con nefritis intersticial aguda, en la glomerulonefritis aguda, en las nefropatías por IgA, en la pielonefritis crónica y en la cistitis. Están muy aumentados en la uropatía obstructiva, la prostatitis, el cáncer de vejiga y el embolismo de colesterol en el riñón. Los eosinófilos requieren la tinción Hansel.
• Histiocitos. Son fagocitos. El núcleo de estas células puede ser alargado, dentado o con forma de huevo. El citoplasma contiene vacuolas y numerosos gránulos gruesos agrupados alrededor del núcleo. La presencia de histiocitos en la orina puede ser indicativa de procesos inflamatorios, mecanismos inmunes o destrucción de eritrocitos. Se pueden confundir con células del epitelio tubular.
• Epitelio tubular. Cuando estas células se encuentran incluidas en la matriz de los cilindros se puede inferir su origen tubular, cuando están libres en la orina no se puede hacer ninguna interpretación en cuanto a su lugar de origen.
• Células epiteliales de transición o urotelios. Revisten la pelvis, los uréteres, la vejiga urinaria y la uretra. Su forma tiende a ser piriforme, redondeada y con prolongaciones en forma de cola. El núcleo es pequeño, oval o redondo, pero bien definido. Los cambios reactivos en los urotelios son los responsables de la presencia de células multinucleadas, las anisocariosis, pequeños nucléolos e hiperplasias en la orina.
• Células de epitelio escamoso. Son células grandes y planas y proceden principalmente de la uretra anterior, el prepucio y la vagina. Si aparecen solas tienen poca significación, cuando aparecen junto con leucocitos hay que hacer la interpretación.
• Cilindros urinarios. Tienen origen en los túbulos renales. Son estructuras celulares organizadas en forma de tubo. Se denominan: cilindros hialinos, cilindros granulares, cilindros cerosos, cilindros grasos, cilindros epiteliales. Los cilindros se disuelven fácilmente en las orinas alcalinas; dependiendo de la composición y cuantía, su presencia en la orina significa inflamación o proceso degenerativo del riñón. La cilindruria nos orienta sobre: el síndrome nefrótico agudo, la glomerulonefritis crónica, la infección complicada de las vías urinarias, la vasculitis necrosante, la rhabdomiolisis, la amiloidosis o el lupus eritematoso.
• Células con procesos benignos. No tumorales y muestran cambios degenerativos como vacuolización citoplasmática, detritus celulares, cuerpos de inclusión.
• Células transformadas. Los criterios principales de malignidad se basan en las alteraciones nucleares observadas: la relación núcleo citoplasma, núcleos de mayor tamaño de lo normal, con poca cantidad de citoplasma, marcadamente hipercromáticos o presencia de sincitios entre otros.
• Bacterias. Las bacterias uropatógenas pueden ser específicas de la especie animal, otras lo son para todas las especies, muchas urobacterias no tienen afinidad por el Gram.
• Fragmentos de tejidos. Los fragmentos de papilas renales es un factor diagnóstico de necrosis papilar.

Figura 1. Diferentes elementos celulares que podemos encontrar en el sedimento urinario.

Otros componentes y/o contaminaciones del sedimento de la orina
En el sedimento urinario también podemos encontrar cristales, moco, espermatozoides, microorganismos...

• Cristales. La cristaluria puede ser completamente asintomática o asociarse con la formación de cálculos en el tracto urinario. La demostración de cristales en determinada cuantía, es sugerente de una enfermedad subyacente o algún desorden alimentario causante de la excreción de cantidades excesivas de un constituyente normal de la orina.
  El tipo de cristaluria es dependiente del pH de la orina. La presencia de microagregados de unidades cristalinas o de sus maclas (crecimiento conjunto de dos o más cristales), se considera como un factor muy alto de riesgo litógeno. Los cristales pueden verse en el sedimento con microscopía de campo claro, pero la diferenciación detallada de distintos cristales requiere el análisis en luz polarizada u otras técnicas. En los animales domésticos los cristales de significación diagnóstica están formados por fosfato amonio magnesio calcio o fosfato triple (estruvita) de origen infeccioso y los de oxalato de calcio o fosfatos, en algunas especies también lo son los de ácido úrico y cistina. En perros sanos de la raza dálmata podemos encontrar cristales de urato de amonio.
• Filamentos mucosos. Son abundantes en inflamaciones que afecten al tracto urinario inferior o hemorragias del tracto urinario, son muy llamativos en la glomerulonefritis aguda.
• Pigmentos. Hemoglobina biliar.
• Espermatozoides. Cuando aparecen de forma abundante, se valorará si existe afección prostática.
• Trichomonas. Multiplican en la vagina, la uretra y la vejiga. En los machos la orina es una muestra útil para la detección siempre que se obtengan los primeros 10 – 30 ml de la micción y la muestra haya sido preservada menos de 24 horas al ambiente ó menos de 5 días en nevera. Aunque casi siempre el hallazgo corresponde a contaminación genital, principalmente en rumiantes, o fecal en gatos.
• Chlamydias. Infectan las células epiteliales, se tiñen con stamp y se confirman en inmunofluorescencia.
• Microsporidios (Encephalitozoon). Principalmente en la orina de los conejos y ratones.
• Capillaria plica. En gatos y perros.
• Leptospira spp. Principalmente en rumiantes, equinos, porcinos y caninos. Cuando están presentes en la orina se requerirá la confirmación haciendo una impregnación argéntica o la identificación con anticuerpos específicos o el cultivo bacteriológico.

Figura 2. Diferentes elementos que podemos encontrar en el sedimento urinario.

Examen Directo

EXAMEN DIRECTO

COPROPARASITOSCOPICO DIRECTO

OBJETIVO

Conocer la importancia del diagnostico del laboratorio de las enfermedades parasitarias de igual manera identificar las diferentes formas parasitarias mediante la observación microscópica.

FUNDAMENTO

El método  coproparasitóscopico  directo es el mas antiguo que se conoce y fue el primero. Utilizado por Antonio Van Lewenhooke en el siglo XVIII observando trofosoitos de Giardia Lambía.

Un examen coproparasitoscopico es el estudio de material fecal para la búsqueda e identificación de formas parasitarias. Puede ser cualitativa o cuantitativa.

En este estudio, el material fecal mas utilizado es el recién obtenido por expulsión natural del paciente, ya sean bien formadas o ecuaciones diminutas en consistencia con moco o sangre. Este método es de gran utilidad para la detección en fresco de trofozoitos de Entamoeba histolitica, Giardia lamblia y Balantidium coli. En la suspensión teñida con lugol se puede identificar con facilidad quistes de protozoos.

·         Este examen en fresco es sencillo, rápido y económico, pues requiere poco material.

·         Es excelente para la búsqueda de trofozoitos y protozoos.

·         Es eficaz para la búsqueda e identificación, de quistes, huevos y larvas.

Sin embargo la muestra utilizada es muy pequeña y poco representativa.

Los montajes en solución salina tienen la ventaja de que retienen la movilidad de los trofozoitos sin embargo es difícil la observación de las estructuras internas pues con frecuencia son poco definidas. El yodo se emplea para detectar las estructuras internas de los parásitos presentes, pero inmóviles trofozoitos.

FROTIS FRESCO

Es un método rápido pero poco seguro. Tiene posibilidad de falsos negativos, por lo que es necesario repetir. Permite observar la motilidad de los microorganismos, Amibas y otros flagelados. Detecta quistes y huevos de helmintos. Precisa una concentración.

MATERIAL

·         Portaobjetos

·         Cubreobjetos

·         Pipeta Pasteur

·         Vaso de precipitado

·         Microscópico

SUSTANCIAS

·         Sol. fisiológica al 0.95

·         Sol.de yodo.

MUESTRA BIOLOGICA

Heces fecales frescas.

PROCEDIMIENTO

1.- Sobre un portaobjetos se coloca una pequeña porción de material fecal.

2.- Se coloca un gota de solución fisiológica.

3.- Se coloca el cubreobjetos.

4.- Observamos sin teñir.

5.- En otro portaobjetos limpio se repite el mismo procedimiento pero ahora se tiñen con la tinción de yodo.

6.- La observación se hace siempre con el objetivo seco débil 10x y con poca luz, al encontrarse con estructuras sospechosas, se observa con el objetivo seco fuerte 40x.

NOTA

Es importante que los frotis no sean densos, si no transparentes. Y que se haga la observación con diferentes muestras.

Tras la observación de los trofozoitos se utiliza la tinción de yodo que tiñe quistes y destaca sus de talles. Los trofozoitos mueren y se hacen identificables.

OBSERVACIONES

Con la solución salina no era muy claro nuestro campo y no lográbamos tener un diagnostico exacto.

Después colocamos nuestro frotis teñido totalmente cambio nuestro campo y pudimos observar y dar los resultados correctos.

·         Restos de alimentos como grasa y cristales de ácidos grasos.

 

MUESTRA                             METODO DIRECTO

Heces                                Efectivo para la búsqueda de trofozoitos móviles o larvas

                                                                                                                   

                                   SOLUCION FISIOLOGICA                        LUGOL

Técnica de Faust

MATERIAL

PORTA OBJETOS 

CUBRE OBJETOS

GASAS

TUBO ENSAYO

EMBUDO

BASO DE PRESIPITADO

ABATE LENGUAS

PROCEDIMIENTO

En un vaso de precipitados (10 ml) mezclar las heces, cuando ya este, en un embudo pequeño con una gasa doblada en 4 vaciar a un tubo de ensaye.

Centrifugar, decantar y volver a centrifugar, repetir el procedimiento hasta que el liquido este listo.

Decantar nuevamente y substituir por zinc, mezclar solución con sedimento y centrifugar.

Con un aza bacteriologica tomar la parte superfucial y hecharle lugol, ponerle porta objetos.

Observar a microscopio.

Técnica Kato

MÉTODO DE KATO KATZ Ó FROTE GRUESO

1.- INTRODUCCIÓN

Este método fue descrito por Kato y Miura en 1954 y antiguamente se denominaba como; frote grueso fue evaluada por Komiya Kobashi y Martín Beaver, quienes introdujeron la modificación de pasar la materia fecal por una malla para evitar el paso de fibras y restos alimenticios no digeridos, lo que mejoró la técnica original.

Es una técnica muy sencilla en cuanto a materiales y reactivos a utilizar, en cuanto a los cálculos para el reporte de resultados estos no representan mayor problema.

Se usada para diagnosticar helmintiasis y cuantificar el hallazgo de huevos, los resultados nos dan la concentración de huevos por gramos de heces.

2.- PRINCIPIO Y METODOLOGÍA DE LA DETERMINACIÓN

Este método se fundamenta en la utilización de glicerina como aclarante y el verde de malaquita como colorante de contraste, además de un cubreobjeto de celofán humedecible, que es el vehículo para la solución de Kato. En este apartado se debe considerar que a través de este método no se diagnosticaran protozoosis por el aclaración que produce la glicerina y el verde de malaquita puede enmascarar la finas estructuras de los parásitos unicelulares. Otro dato a tener en cuenta es que cuando se tratan de parasitosis mixtas como geohelmintiasis con himenolepiosis los huevos de estos últimos son delicados y aclaran mas rápido que los de nematelmintos.

3.- LISTA DE REQUERIMIENTOS

  3.1 Reactivos

-Glicerina

-Verde de malaquita

-Agua destilada

  3.2 Equipos de Laboratorio

-Microscopios.

-Estufa de cultivo.

  3.3 Materiales de laboratorio

-Cuadros de malla para mosquitero de 10 cm x lado

-Cuadros de papel celofán de 22 x 40 mm (como portaobjeto)

-Cuadros de cartón de 3 mm de grosor y de 30 mm de lado con una perforación en el centro de 6 mm de diámetro.

-Papel encerado

-Papel absorbente

-Abatelenguas o Aplicadores

-Portaobjetos

4.- TÉCNICA O PROCEDIMIENTO

1. Depositar sobre el papel encerado 5 grs de materia fecal

2. colocar la malla sobre la materia

3. Presionar la malla para que salga el tamizado.

4. Se efectúa una horadación de 0.6 cm. de diámetro en cartón de cascaron y se coloca sobre un portaobjeto.

5. Dentro del circulo se introduce la muestra de materia fecal (50 mg) .

6. Con sumo cuidado retirar el soporte de papel cascaron o cartón.

7. El excremento quedara en forma cilíndrica.

8. Cubrirlo con un fragmento de celofán (22 x 30 mm) que se encuentra previamente humedecido con glicerina y verde de malaquita 3% durante 24 hrs.

9. Hacer un squash con la ayuda de papel adsorbente, con el propósito de eliminar el exceso de glicerina y de lograr una extensión delgada, apta para la observación.

10. dejar reposar durante 20 ó 30 minutos a 37 grados centígrados para aclaración del material fecal (pero no de los huevos)

11. Examinar al microscopio para su cuantificación.

4.1 Muestreo y muestra

4.1.1 La Obtención de muestra debe ser; expulsión de manera natural

4.1.2 En frasco de boca ancha etiquetados con; nombre

4.2 Preparación del sistema de Medición

4.2.1. Seguir las Instrucciones de limpieza y manejo del microscopio.

4.3 Uso del sistema de Medición (Proceso de lectura y / u observaciones)

4.3.1 Enfocar al microscopio la preparación con objetivo 10 X.

4.3.2. Realizar la lectura de la totalidad de la preparación de manera sistemática.

4.3.3. Reportar según indicaciones en el apartado reporte de resultados.

4.3.4. Terminado el proceso apagar el equipo, limpiar y enrollar perfectamente el cordón.

4.3.5 Desechar los materiales de acuerdo con el procedimiento de desecho estándar

5.- PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

De acuerdo con la formula establecida, calcular la concentración de la sustancia en las unidades respectivas.

5.1 Calculo de resultados

El número de huevos contados en toda la preparación se multiplica por un factor constante de 20;

Si en 50 mg. de la muestra se encontró un huevo, como 1 gr. Tiene 1000 mgs. Se hace una regla de tres y por consiguiente 1000 dividido entre 50 dará un factor de 20, que es el que se utilizará para multiplicar el número de huevos contados en la preparación.

5.2 Reporte de resultados

El resultado se expresa en huevos por gramos de heces (hgh) ó larvas por gramos de heces (lgh)

6.- CONFIABILIDAD ANALÍTICA

6.1 Se debe evitar que el tiempo de aclaración se exceda, pues esto dificulta la observación de los huevos.

7.- CONTROL DE CALIDAD

Solo la práctica de la técnica durante varias veces ayudará a establecer los tiempos específicos para cada espécimen.

8.- PRACTICABILIDAD

8.1 Debe ser un estudiante de Química Clínica, Químico Fármaco biólogo ó Químico Biólogo parasitólogo con supervisado por el facilitador de la Experiencia Educativa.